Skysčių chromatografija yra pagrindinis metodas tiriant kiekvieno komponento ir priemaišų kiekį žaliavose, tarpiniuose produktuose, preparatuose ir pakavimo medžiagose, tačiau daugelis medžiagų neturi standartinių metodų, kuriais būtų galima pasikliauti, todėl neišvengiama naujų metodų kūrimo. Kuriant skystosios fazės metodus, chromatografinė kolonėlė yra skysčių chromatografijos šerdis, todėl labai svarbu, kaip pasirinkti tinkamą chromatografinę kolonėlę. Šiame straipsnyje autorius paaiškins, kaip pasirinkti skysčių chromatografijos kolonėlę iš trijų aspektų: bendrų idėjų, svarstymų ir taikymo srities.
A. Bendros idėjos, kaip pasirinkti skysčių chromatografijos kolonėles
1. Įvertinkite analitės fizines ir chemines savybes: tokias kaip cheminė struktūra, tirpumas, stabilumas (pvz., ar lengva oksiduotis/redukuoti/hidrolizuoti), rūgštingumą ir šarmingumą ir kt., ypač svarbi cheminė struktūra. veiksnys, lemiantis savybes, pvz., konjuguota grupė turi stiprią ultravioletinių spindulių absorbciją ir stiprią fluorescenciją;
2. Nustatykite analizės tikslą: ar reikalingas didelis atskyrimas, didelis kolonėlės efektyvumas, trumpas analizės laikas, didelis jautrumas, atsparumas aukštam slėgiui, ilgas kolonėlės tarnavimo laikas, maža kaina ir kt.;
- Pasirinkite tinkamą chromatografinę kolonėlę: supraskite chromatografinio užpildo sudėtį, fizines ir chemines savybes, pvz., dalelių dydį, porų dydį, temperatūros toleranciją, pH toleranciją, analitės adsorbciją ir kt.
- Skysčių chromatografijos kolonėlių pasirinkimo aplinkybės
Šiame skyriuje bus aptariami veiksniai, į kuriuos reikia atsižvelgti renkantis chromatografijos kolonėlę, atsižvelgiant į pačios chromatografijos kolonėlės fizines ir chemines savybes. 2.1 Užpildo matrica
2.1.1 Silikagelio matrica Daugumos skysčių chromatografijos kolonėlių užpildo matrica yra silikagelis. Šio tipo užpildas pasižymi dideliu grynumu, mažomis sąnaudomis, dideliu mechaniniu stiprumu ir lengvai modifikuojamas grupes (pvz., fenilo jungimas, amino jungtis, ciano jungtis ir kt.), tačiau pH vertė ir temperatūros diapazonas, kurį jis toleruoja, yra riboti: Daugumos silikagelio matricos užpildų pH diapazonas yra nuo 2 iki 8, tačiau specialiai modifikuotų silikagelio fazių pH diapazonas gali būti nuo 1,5 iki 10, taip pat yra specialiai modifikuotų silikageliu sujungtų fazių, kurios yra stabilios esant žemam pH. pvz., Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, kuris yra stabilus esant pH nuo 1 iki 8; viršutinė silikagelio matricos temperatūros riba paprastai yra 60 ℃, o kai kurios chromatografinės kolonėlės gali toleruoti 40 ℃ temperatūrą esant aukštam pH.
2.1.2 Polimerinė matrica Polimeriniai užpildai dažniausiai yra polistirenas-divinilbenzenas arba polimetakrilatas. Jų privalumai yra tai, kad jie toleruoja platų pH diapazoną – gali būti naudojami nuo 1 iki 14, jie yra atsparesni aukštai temperatūrai (gali siekti virš 80 °C). Palyginti su silicio dioksido pagrindu pagamintais C18 užpildais, šio tipo užpildai turi stipresnį hidrofobiškumą, o makroporuotas polimeras labai efektyviai atskiria mėginius, tokius kaip baltymai. Jo trūkumai yra tai, kad kolonėlės efektyvumas yra mažesnis, o mechaninis stiprumas silpnesnis nei užpildų silicio dioksido pagrindu. 2.2 Dalelių forma
Dauguma šiuolaikinių HPLC užpildų yra sferinės dalelės, tačiau kartais tai yra netaisyklingos dalelės. Sferinės dalelės gali užtikrinti mažesnį kolonėlės slėgį, didesnį kolonėlės efektyvumą, stabilumą ir ilgesnį tarnavimo laiką; naudojant didelio klampumo judančias fazes (pvz., fosforo rūgštį) arba kai mėginio tirpalas yra klampus, netaisyklingos dalelės turi didesnį specifinį paviršiaus plotą, kuris yra palankesnis visiškam dviejų fazių veikimui, o kaina yra palyginti maža. 2.3 Dalelių dydis
Kuo mažesnis dalelių dydis, tuo didesnis kolonėlės efektyvumas ir didesnis atskyrimas, tačiau tuo prastesnis atsparumas aukštam slėgiui. Dažniausiai naudojama 5 μm dalelių dydžio kolonėlė; jei atskyrimo reikalavimas yra didelis, galima pasirinkti 1,5-3 μm užpildą, kuris padeda išspręsti kai kurių sudėtingų matricų ir daugiakomponentinių mėginių atskyrimo problemą. UPLC gali naudoti 1,5 μm užpildus; Pusiau paruošiamoms arba preparatinėms kolonoms dažnai naudojami 10 μm ar didesnių dalelių užpildai. 2.4 Anglies kiekis
Anglies kiekis reiškia surištos fazės dalį silikagelio paviršiuje, kuri yra susijusi su specifiniu paviršiaus plotu ir surištos fazės padengimu. Didelis anglies kiekis užtikrina didelę kolonėlės talpą ir didelę skiriamąją gebą, dažnai naudojamas sudėtingiems mėginiams, kuriems reikalingas didelis atskyrimas, tačiau dėl ilgos dviejų fazių sąveikos trukmės analizės laikas yra ilgas; Mažo anglies kiekio chromatografinės kolonėlės turi trumpesnį analizės laiką ir gali rodyti skirtingą selektyvumą, todėl dažnai naudojamos paprastiems mėginiams, kuriems reikalinga greita analizė, ir mėginiams, kuriems reikalingos didelės vandeninės fazės sąlygos. Paprastai anglies kiekis C18 svyruoja nuo 7% iki 19%. 2.5 Porų dydis ir specifinis paviršiaus plotas
HPLC adsorbcijos terpė yra porėtos dalelės, o dauguma sąveikų vyksta porose. Todėl molekulės turi patekti į poras, kad jos būtų adsorbuotos ir atskirtos.
Porų dydis ir specifinis paviršiaus plotas yra dvi viena kitą papildančios sąvokos. Mažas porų dydis reiškia didelį specifinį paviršiaus plotą ir atvirkščiai. Didelis specifinis paviršiaus plotas gali padidinti sąveiką tarp mėginio molekulių ir surištų fazių, sustiprinti sulaikymą, padidinti mėginio apkrovą ir kolonėlės talpą bei atskirti sudėtingus komponentus. Šiai užpildų rūšiai priklauso visiškai porėti užpildai. Turintiems aukštus atskyrimo reikalavimus rekomenduojama rinktis didelio specifinio paviršiaus užpildus; mažas specifinis paviršiaus plotas gali sumažinti priešslėgį, pagerinti kolonėlės efektyvumą ir sumažinti pusiausvyros laiką, kuris tinka gradiento analizei. Šio tipo užpildams priklauso šerdies apvalkalo užpildai. Siekiant užtikrinti atskyrimą, tiems, kuriems keliami aukšti analizės efektyvumo reikalavimai, rekomenduojama rinktis mažo specifinio paviršiaus užpildus. 2.6 Porų tūris ir mechaninis stiprumas
Porų tūris, taip pat žinomas kaip „porų tūris“, reiškia tuštumos tūrį dalelės vienete. Jis gali gerai atspindėti užpildo mechaninį stiprumą. Didelio porų tūrio užpildų mechaninis stiprumas yra šiek tiek silpnesnis nei užpildų, kurių porų tūris yra mažas. Užpildai, kurių porų tūris yra mažesnis arba lygus 1,5 mL/g, dažniausiai naudojami HPLC atskyrimui, o užpildai, kurių porų tūris didesnis nei 1,5 mL/g, daugiausia naudojami molekulinei išskyrimo chromatografijai ir žemo slėgio chromatografijai. 2.7 Viršutinės ribos norma
Uždengimas gali sumažinti uodegos smailes, atsirandančias dėl sąveikos tarp junginių ir atvirų silanolio grupių (tokių kaip joninis ryšys tarp šarminių junginių ir silanolio grupių, van der Waals jėgos ir vandeniliniai ryšiai tarp rūgščių junginių ir silanolio grupių), taip pagerinant kolonėlės efektyvumą ir smailės formą. . Neuždengtos surištos fazės sukels skirtingą selektyvumą, palyginti su uždarytomis surištomis fazėmis, ypač poliniams mėginiams.
- Įvairių skysčių chromatografijos kolonėlių taikymo sritis
Šiame skyriuje kai kuriais atvejais bus aprašyta skirtingų tipų skysčių chromatografijos kolonėlių taikymo sritis.
3.1 Atvirkštinės fazės C18 chromatografinė kolonėlė
C18 kolonėlė yra dažniausiai naudojama atvirkštinės fazės kolonėlė, kuri gali atitikti daugumos organinių medžiagų kiekio ir priemaišų testus ir tinka vidutinio poliškumo, silpnai polinėms ir nepolinėms medžiagoms. C18 chromatografinės kolonėlės tipas ir specifikacija turėtų būti parenkami pagal konkrečius atskyrimo reikalavimus. Pavyzdžiui, medžiagoms, kurioms keliami dideli atskyrimo reikalavimai, dažnai naudojamos 5 μm*4,6 mm*250 mm specifikacijos; medžiagoms su sudėtingomis atskyrimo matricomis ir panašiu poliškumu galima naudoti 4 μm*4,6 mm*250 mm specifikacijas arba mažesnius dalelių dydžius. Pavyzdžiui, autorius naudojo 3 μm * 4,6 mm * 250 mm kolonėlę, kad aptiktų dvi genotoksines priemaišas celekoksibo API. Dviejų medžiagų atskyrimas gali siekti 2,9, o tai yra puiku. Be to, siekiant užtikrinti atskyrimą, jei reikia greitos analizės, dažnai pasirenkamas trumpas 10 mm arba 15 mm stulpelis. Pavyzdžiui, kai autorius naudojo LC-MS/MS, kad nustatytų genotoksinę priemaišą piperakvino fosfato API, buvo naudojama 3 μm * 2,1 mm * 100 mm kolonėlė. Atskyrimas tarp priemaišos ir pagrindinio komponento buvo 2,0, o mėginio aptikimas gali būti baigtas per 5 minutes. 3.2 Atvirkštinės fazės fenilo kolonėlė
Fenilo kolonėlė taip pat yra atvirkštinės fazės kolonėlės tipas. Šio tipo kolonėlės pasižymi dideliu selektyvumu aromatiniams junginiams. Jei aromatinių junginių reakcija, išmatuota naudojant paprastą C18 kolonėlę, yra silpna, galite apsvarstyti galimybę pakeisti fenilo kolonėlę. Pavyzdžiui, kai gaminau celekoksibo API, pagrindinio komponento atsakas, išmatuotas pagal to paties gamintojo fenilo kolonėlę ir tą pačią specifikaciją (visi 5 μm * 4,6 mm * 250 mm), buvo maždaug 7 kartus didesnis nei C18 kolonėlės. 3.3 Normalios fazės kolonėlė
Kaip veiksmingas atvirkštinės fazės kolonėlės priedas, normalios fazės kolonėlė tinka labai poliniams junginiams. Jei smailė vis dar yra labai greita eliuuojant su daugiau nei 90 % vandenine faze atvirkštinės fazės kolonėlėje ir netgi artima tirpiklio smailei ir su ja sutampa, galite apsvarstyti galimybę pakeisti normalios fazės kolonėlę. Šio tipo stulpeliai apima hilic koloną, amino stulpelį, ciano koloną ir kt.
3.3.1 Hilic kolonėlė Hilic kolonėlė paprastai įterpia hidrofilines grupes į sujungtą alkilo grandinę, kad sustiprintų atsaką į polines medžiagas. Šio tipo kolonėlės tinka cukraus medžiagų analizei. Šio tipo stulpelius autorius naudojo atlikdamas ksilozės ir jos darinių turinį ir susijusias medžiagas. Ksilozės darinio izomerai taip pat gali būti gerai atskirti;
3.3.2 Amino kolonėlė ir ciano kolonėlė Amino kolonėlė ir ciano kolonėlė reiškia amino ir ciano modifikacijų įvedimą atitinkamai surištos alkilo grandinės gale, siekiant pagerinti specialių medžiagų selektyvumą: pavyzdžiui, amino kolonėlė yra geras pasirinkimas cukrų, aminorūgščių, bazių ir amidų atskyrimui; ciano kolonėlė pasižymi geresniu selektyvumu atskiriant hidrintas ir nehidrintas struktūrines panašias medžiagas dėl konjuguotų jungčių. Amino kolonėlę ir ciano kolonėlę dažnai galima perjungti tarp įprastos fazės kolonėlės ir atvirkštinės fazės kolonėlės, tačiau dažnai perjungti nerekomenduojama. 3.4 Chiralinė kolonėlė
Chiralinė kolonėlė, kaip rodo pavadinimas, tinka chiralinių junginių atskyrimui ir analizei, ypač farmacijos srityje. Tokio tipo kolonėlės gali būti naudojamos, kai įprastos atvirkštinės fazės ir normalios fazės kolonėlės negali atskirti izomerų. Pavyzdžiui, autorius panaudojo 5 μm*4,6 mm*250 mm chiralinę kolonėlę, kad atskirtų du 1,2-difeniletilendiamino izomerus: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiaminą ir (1R, 2R)-1, 2. -difeniletilendiaminas, o atskyrimas tarp jų siekė apie 2,0. Tačiau chiralinės kolonos yra brangesnės nei kitų tipų kolonėlės, dažniausiai 1W+/vnt. Jei tokių stulpelių reikia, vienetui reikia turėti pakankamą biudžetą. 3.5 Jonų mainų kolonėlė
Jonų mainų kolonėlės tinka įkrautiems jonams, tokiems kaip jonai, baltymai, nukleino rūgštys ir kai kurios cukraus medžiagos, atskirti ir analizuoti. Pagal užpildo tipą jie skirstomi į katijonų mainų kolonėles, anijonų mainų kolonėles ir stipriąsias katijonų mainų kolonėles.
Katijonų mainų kolonėlės apima kalcio ir vandenilio pagrindo kolonėles, kurios daugiausia tinka katijoninėms medžiagoms, tokioms kaip aminorūgštys, analizuoti. Pavyzdžiui, analizuodamas kalcio gliukonatą ir kalcio acetatą skalavimo tirpale autorius naudojo kalcio pagrindu pagamintas kolonėles. Abi medžiagos turėjo stiprų atsaką esant λ=210 nm, o atskyrimo laipsnis siekė 3,0; autorius, analizuodamas su gliukoze susijusias medžiagas, naudojo vandenilio pagrindo stulpelius. Kai kurios pagrindinės susijusios medžiagos – maltozė, maltotriozė ir fruktozė – buvo labai jautrios diferencialiniuose detektoriuose, kurių aptikimo riba buvo tik 0,5 ppm, o atskyrimo laipsnis – 2,0–2,5.
Anijonų mainų kolonėlės daugiausia tinka anijoninėms medžiagoms, tokioms kaip organinės rūgštys ir halogeno jonai, analizuoti; stiprios katijonų mainų kolonėlės turi didesnį jonų mainų pajėgumą ir selektyvumą, tinka sudėtingiems mėginiams atskirti ir analizuoti.
Tai tik įvadas į kelių įprastų skysčių chromatografijos kolonėlių tipus ir taikymo sritis kartu su paties autoriaus patirtimi. Yra ir kitų specialių tipų chromatografinių kolonėlių, tokių kaip didelių porų chromatografinės kolonėlės, mažų porų chromatografinės kolonėlės, afininės chromatografijos kolonėlės, daugiamodės chromatografijos kolonėlės, itin didelio efektyvumo skysčių chromatografijos kolonėlės (UHPLC), superkritinių skysčių chromatografijos kolonėlės ( SFC) ir tt Jie atlieka svarbų vaidmenį įvairiose srityse. Konkretus chromatografinės kolonėlės tipas turi būti parenkamas atsižvelgiant į mėginio struktūrą ir savybes, atskyrimo reikalavimus ir kitus tikslus.
Paskelbimo laikas: 2024-06-14